Detección rápida, sensible y reproducible de adulterantes en leche líquida, empleando un espectrómetro Raman portátil y la optimización de un sencillo porta muestras.

April 11, 2018

Basado en: Rapid, sensitive, and reproducible screening of liquid milk for adulterants using a portable Raman spectrometer and a simple, optimized sample well M. K. Niewoudt, S. E. Holroyd, C. M. McGoverin, M. C. Simpson, and D. E. Williams.

Resumen

El presente artículo presenta un poderoso método espectroscópico para el análisis rápido de la leche líquida en busca de adulterantes, combinando pozos de enfoque reflectantes fabricados de una manera muy sencilla en aluminio con un pequeño espectrómetro Raman portátil y una sonda de fibra óptica. Los pozos hemisféricos para muestras construidos en aluminio se diseñaron especialmente para optimizar la reflexión interna y el volumen de muestreo al hacer coincidir la longitud focal del espejo con la profundidad del foco de la sonda láser. La técnica se probó en leche adulterada con cuatro compuestos diferentes ricos en nitrógeno (melamina, urea, diciandiamida y sulfato de amonio) y sacarosa. No se necesitó ninguna preparación de muestra de la leche, y el tiempo de análisis total fue de cuatro minutos.

La presentación confiable de la muestra permitió una reproducibilidad promedio del 8% de la desviación estándar residual. El límite del intervalo de detección medido a partir de las calibraciones de mínimos cuadrados parciales varió entre 140 y 520 mg/L para los cuatro compuestos ricos en Nitrógeno y entre 7000 y 36000 mg/L (0.7-3.6%) para la sacarosa. La portabilidad del sistema y la confiabilidad y reproducibilidad de esta técnica abren oportunidades para el análisis general, sin reactivos, de la leche para los adulterantes en el punto de recolección.

Introducción

La espectroscopía Raman proporciona una gran cantidad de información como una herramienta analítica para el análisis de las vibraciones de las moléculas debido a la rica complejidad inherente en sus señales. Proporciona una huella digital única de una molécula que es sensible tanto a su estructura molecular como a su composición y, por lo tanto, permite la identificación de diferentes polimorfismos y fases del mismo compuesto en diferentes entornos. Dos de las principales ventajas de Raman sobre la técnica complementaria de espectroscopía infrarroja son: la muy baja señal del agua y bandas normalmente más finas; lo que mejora la sensibilidad para el análisis de soluciones acuosas. El uso adicional de métodos de análisis multivariado permite el análisis cuantitativo simultáneo y sensible de múltiples analitos (Cooper, 1991; Potyrailo, 2001; López-Díez y Goodacre, 2004). Los avances recientes en el diseño y fabricación de detectores, gratings y sondas de fibra óptica han llevado a la producción de una amplia variedad de espectrómetros Raman portátiles que son alternativas viables a los espectrómetros de mesa (Smith, 2000; Eckenrode et al., 2001; iRaman Plus, B&WTek Inc., Newark, DE). Su portabilidad ya ha permitido el análisis Raman en el sitio de una variedad de muestras antes consideradas intratables (Kawai y Janni 2000; Aramendia et al., 2012; Karabeber et al., 2014). La fácil incorporación de fibra óptica ha extendido su aplicación en la industria al análisis de procesos en línea y monitoreo de reacciones (Cooper, 1991; Svensson et al., 1999; Mulvaney y Keating, 2000; Lewis y Edwards, 2001) y en medicina al seguimiento en tiempo real de melanomas, cáncer de mama e identificación in situ de células residuales de astrocitoma durante cirugía cerebral (Brozek-Pluska et al., 2012; Lui et al., 2012). El análisis no invasivo de múltiples componentes sin la necesidad de ninguna preparación de muestras es particularmente ventajoso en estas aplicaciones.

En 2008, se produjo un temor internacional a la salud debido a la adulteración de la leche en polvo y de fórmulas infantiles con melamina. Esta adulteración resultó en la enfermedad de más de 300,000 personas y la muerte de 3 bebés XXXXXXXXX. La adición de melamina a la leche fue motivada por el beneficio económico; la triazina melamina rica en N aumenta el contenido aparente de proteína de la leche. La proteína se mide de forma convencional utilizando las pruebas analíticas Kjeldahl o Dumas o ambas (Moore et al., 2010); estas pruebas miden la concentración de nitrógeno y son ciegas a la fuente de nitrógeno medida. El evento de adulteración de 2008 provocó el desarrollo de varios métodos analíticos diferentes para analizar la melamina, y estos métodos se han revisado minuciosamente (Sun et al., 2010; Tittlemier, 2010; Liu et al., 2012). El evento también provocó varios estudios de espectroscopía Raman y Raman de transformada de Fourier para detectar melamina y otros compuestos ricos en N tales como diciandiamida (DCD), urea y sulfato de amonio en leche en polvo (Qin et al., 2010, 2012, 2013; Chao et al., 2013). Estos estudios lograron límites de detección (LOD) de 1000 mg/L para los 4 compuestos.

En otros estudios, se empleó espectroscopía Raman mejorada en la superficie (SERS) para mejorar la sensibilidad de los niveles de detección de melamina y bajó el LOD a un rango de 1×10ˉ⁴ a 2 mg/L (Kim et al., 2012; Mecker et al., 2012; Zhao et al., 2013; Zou et al., 2013; Giovannozzi et al., 2014; Guo et al., 2014; Yang et al., 2014). Sin embargo, la fiabilidad de SERS para el análisis cuantitativo se vio obstaculizada por su baja reproducibilidad (Moskovits, 2013). Además, estos métodos SERS requerían uno o más pasos de preparación, tales como la adición de productos químicos, centrifugación o filtración, para eliminar la fracción de proteína de la muestra de leche.

Otra limitación del uso de estos análisis SERS para la melamina en la leche fue el bajo rango de concentración en donde se encontraba una variación lineal de la intensidad espectral con respecto a la concentración. Este rango variaba en promedio entre 0 a 50 mg/L, permaneciendo por debajo de los niveles de 90 a 4000 mg/L estimados para la adulteración con compuestos ricos en N (Abernethy y Higgs, 2013).

Los autores optimizaron previamente la técnica espectroscópica Raman para mejorar la sensibilidad de detección en la leche para las mismas cuatro moléculas ricas en N (melamina, urea, DCD, sulfato de amonio) y sacarosa en la leche sin el uso de SERS. En ese estudio, se alcanzaron intervalos de LOD mínimo a máximo entre 100 y 600 mg/L para los compuestos ricos en N y 7000 a 25000 mg/L (0.7-2.5%) para sacarosa (Nieuwoudt et al. , 2016). En el presente estudio, se optimizó la presentación de la muestra y se investigó el uso de un pequeño y portátil espectrómetro Raman con una sonda de fibra óptica de enfoque para la detección de leche líquida para estos compuestos. La intensidad de Raman puede aumentarse al aumentar el volumen de leche muestreada, lo que se puede lograr optimizando el diseño de pozos de muestreo para usar con una sonda de fibra óptica Raman. Se puede obtener un mayor volumen de muestra maximizando la reflexión del láser incidente a través de la muestra, utilizando espejos parabólicos o semiesféricos; la recolección de la luz dispersada también aumentaría presumiblemente por la reflexión de las superficies curvas cercanas al punto de enfoque. Se seleccionó un espejo semiesférico por su facilidad de preparación. Aunque los espejos parabólicos son capaces de enfocar los haces paralelos entrantes a un solo punto, son más difíciles de hacer. Además, el astigmatismo de un espejo semiesférico para el rayo láser incidente muy angosto de la sonda de fibra óptica utilizada en este estudio (<100 μm) sería insignificante y se acomodaría fácilmente a la óptica de la sonda.)

Resultados y discusiones

En la Figura 1a se muestra una imagen óptica de uno de los pozos hechos con una bola de 2,38 mm. La superficie hemisférica de los pozos era de calidad de un espejo. La profundidad promedio de los pozos fue de 530 μm, y la reproducibilidad de la profundidad del pozo fue de 1.0%, medida como el porcentaje de la desviación estándar relativa (% RSD) para 7 pozos adyacentes. Los pozos especulares semiesféricos se llenaron con 1 μL de leche (Figura 1b) y los espectros se registraron utilizando la sonda de fibra óptica enfocada en la superficie de la leche (Figura 1c). Se espera que la altura del menisco sea inferior a 530 μm y cercana a la altura requerida de 450 μm.

Se prepararon otros pozos de diferentes tamaños utilizando cojinetes de bolas de tamaños 2, 3 y 10 mm, y se registraron los espectros de leche utilizando estos pozos llenos (Figura 2). Aunque los espectros registrados en los pozos hechos con cojinetes de bolas de 2 mm fueron los más intensos, fue difícil llenar estos pozos sin introducir burbujas de aire. Los pozos hechos con bolas de 2,38 mm dieron como resultado espectros de intensidad similar y fueron más fáciles de llenar sin burbujas de aire. Los espectros registrados en los pozos hechos con bolas de 3 y 10 mm fueron significativamente más débiles (Figura 2), lo que puede explicarse por la pérdida de reflexión interna desde la base del pozo debido a la mayor profundidad de la leche, por encima del nivel óptimo de 450 μm. Por lo tanto, se recogieron datos adicionales usando solo pozos de 2,38 mm.

Los espectros corregidos por línea base registrados de las soluciones de leche adulteradas con diferentes concentraciones entre 50 y 3000 mg/L para cada uno de las cuatro moléculas ricas en N se muestran en la Figura 3; solo se muestra un espectro por concentración. En los espectros se indican las 2 bandas debido a los modos de estiramiento C=N para DCD en 2.198 y 2.160 cmˉ¹ (Lin et al., 2015) y la fuerte vibración Raman en modo de respiración del anillo en el plano para la melamina a 680 cm-1 (Koglin et al., 1996). También se resaltan el fuerte estiramiento N-C-N para urea y el estiramiento simétrico para SO4ˉ² en sulfato de amonio a 1008 cmˉ¹ y 976 cmˉ¹, respectivamente (Kettle et al., 1984; Keuleers et al., 1999), y el estiramiento N-N-N a 926 cmˉ¹ para DCD. El uso de PLS significa que cualquier superposición de picos adulterantes, como la banda de 976 cmˉ¹ para SO4ˉ² y la banda débil de 983 cmˉ¹ para la melamina, no sería problemático para la cuantificación de adulterantes en las muestras de leche. De manera similar, los espectros de muestra registrados de cada una de las soluciones de leche de sacarosa entre 5000 y 40000 mg/L (0.5-4.0%) son mostrados en la Figura 4. Los estiramientos C-O y C-OH dan lugar a las bandas alrededor de 1065 cmˉ¹; las bandas alrededor de 850 cm-1 se deben a los modos de estiramiento C-H y C-C, y aquellas alrededor de 550 cmˉ¹ se deben a deformaciones C-C-O (Mathlouthi y Luu, 1980).

En ambas figuras, los espectros se han normalizado a la misma altura para la banda de deformación de etilo de lípidos de leche a 1300 cmˉ¹ (Sadeghi-Jorabchi et al., 1991). La variación de la intensidad con la concentración para la sacarosa y los compuestos riccos en N resulta evidente a partir de los espectros. Se construyeron modelos de calibración de mínimos cuadrados parciales para cada uno de los compuestos ricos en N mediante el uso de los 40 espectros de entrenamiento, y las concentraciones de las 20 muestras de validación se predijeron posteriormente. Para el modelo de calibración de sacarosa, se utilizaron los 27 espectros para el conjunto de entrenamiento, y el modelo se probó usando una validación cruzada interna completa. El R2, RMSECV y los intervalos LOD determinados a partir de los modelos de calibración PLS para cada componente se muestran en la Tabla 1. Los valores SEP obtenidos para las validaciones también se dan en la tabla; estos se usaron para determinar el RPD para la predicción. Los resultados de RPD para los compuestos ricos en N (3.7-4.9) clasifican sus calibraciones como adecuadas para el análisis de rutina de estos compuestos. Para la sacarosa, el valor obtenido de 9.1 permitiría usar la calibración PLS para ser usada para cualquier aplicación analítica. Los coeficientes de regresión PLS para cada componente muestran valores aumentados en los números de onda que corresponden a las bandas más fuertes en sus espectros Raman (Figura 5).

La reproducibilidad de los espectros se midió en términos de % RSD, calculada a partir de la altura de la banda a partir de 2 espectros diferentes para cada uno de los cuatro compuestos ricos en N y a partir de 3 espectros diferentes para cada uno de los espectros de sacarosa. El valor promedio global de % RSD para todas las concentraciones de los compuestos ricos en N fue del 8% y para la sacarosa del 10%; estos valores se incluyen en la Tabla 1.

Los LOD obtenidos de las calibraciones de PLS se determinaron como un intervalo específico para el rango de concentración de muestra (Tabla 1). Los valores de LODmax generalmente correspondieron entre 3 y 4 veces los valores de LODmin. Los valores de LODmin para estos compuestos ricos en N se compararon favorablemente con los obtenidos utilizando un sistema de microsonda Raman de laboratorio mucho más costoso (Nieuwoudt et al., 2016), pero los valores de LODmax fueron de 1,5 a 2 veces mayores. Sin embargo, el intervalo de LOD se ajustó bien dentro de la región inferior de los niveles esperados para la adulteración con estos compuestos (Abernethy y Higgs, 2013).

Los niveles de LOD para sacarosa fueron aproximadamente dos veces los obtenidos con el sistema de laboratorio, pero fueron comparables con los obtenidos en un estudio de infrarrojo cercano de sacarosa en leche en polvo (Boring et al., 2006) en el cual los valores de LOD variaron entre 8600 y 25800 mg/L (0,86 – 2,5%).

Las predicciones PLS-DA para el conjunto de validación de 40 muestras consistentes en muestras de leche pura (círculos abiertos), leche adulterada con compuestos ricos en N [círculos grises claros (azules)] y leche adulterada con sacarosa [gris oscuro sólido ( círculos rojos) ] se muestran en la Figura 6. No se produjeron falsos negativos ni falsos positivos, lo que arroja un 100% de selectividad y eficiencia para esté método de clasificación. Sin embargo, los espectros de sacarosa en el conjunto de validación solo pudieron clasificarse como adulterados si los espectros de sacarosa también se incluyeron en el conjunto de entrenamiento.

Cuando los espectros de sacarosa se añadieron al conjunto de validación por separado sin ser incluidos en el conjunto de entrenamiento PLS-DA, estos espectros se clasificaron incorrectamente como leche pura. De forma similar, cuando se excluyó melamina del grupo de entrenamiento, los espectros de validación en el rango de concentración de 100 a 750 mg/L se clasificaron falsamente como puros, y cuando se excluyó la urea todos los espectros (100-1000 mg/L) se clasificaron falsamente como puros. Estos resultados resaltan la necesidad de incluir estos compuestos en el conjunto de entrenamiento para una clasificación precisa. Curiosamente, tanto las muestras de DCD como las de sulfato de amonio se clasificaron correctamente como adulteradas incluso cuando estos compuestos se excluyeron del grupo de entrenamiento.

Conclusiones

Los pozos Hemisféricos de aluminio fueron diseñados para su uso con un espectrómetro Raman portátil y una sonda de fibra óptica de enfoque para registrar espectros de alta calidad de leche líquida adulterada. Los espectros se registraron directamente a partir de muestras de leche de 1 μL en los pocillos de Al, y no se requirió preparación de muestra. Los espectros recogidos fueron reproducibles, con un % RSD promedio del 8% para los compuestos ricos en N y del 10% para la sacarosa. Los valores de SEP obtenidos a partir de las predicciones de PLS oscilaron entre 39 y 72 mg/L para los cuatro compuestos ricos en N (conjuntos de validación separados) y fue de 1400 mg/L (0,14%) para la sacarosa (validación cruzada interna). Un modelo PLS-DA evaluó un conjunto de validación con 40 muestras de leche pura y adulterada con 100% de selectividad y eficiencia.

Los pozos Al se fabricaron fácil y económicamente imprimiendo Al con bolas de acero inoxidable de diámetro apropiado y con excelente reproducibilidad (1% de RSD) con respecto a la profundidad del pozo. La confiabilidad de esta técnica para el análisis de leche líquida sin la necesidad de preparación de muestras o la adición de productos químicos proporciona un paso significativo para garantizar la seguridad alimentaria en países en desarrollo. La portabilidad del sistema y el creciente número de sistemas Raman portátiles asequibles disponibles comercialmente hacen que este método sea viable para detectar adulterantes de leche en el punto de recolección.

Figura 1. (a) Imagen óptica de un pozo de forma hemisférica construido en un bloque de aluminio usando una bola de acero inoxidable SS316 de 2,38 mm a una profundidad de alrededor de 530 μm. (b) Pozo hemisférico en aluminio fabricado por indentación con una bola SS316 de 2,38 mm, llena con 1 μL de leche líquida (c) Sonda de fibra óptica enfocada en la superficie de la leche en un pozo hemisférico. La distancia focal fue de 5.7 mm

Figura 2. Espectros registrados a partir de 1 μL de leche líquida depositada en pozos fabricados por la impresión de bolas de acero inoxidable con diámetros de 2, 2,38, 3 y 10 mm en una superficie de aluminio. Se muestran los espectros recolectados a partir de dos pozos adyacentes.

Figura 3. Espectros de soluciones de leche que contienen diferentes concentraciones de melamina (Mel), urea, diciandiamida (DCD) y sulfato de amonio (AmS). Las flechas indican las bandas más fuertes características para cada componente. Los espectros se corrigieron y se normalizaron al pico de deformación de etilo de 1300 cm-1. Para cada adulterante, los espectros se muestran en orden de mayor a menor concentración, coincidiendo con el orden de la leyenda.


Figura 4. Espectros de soluciones lácteas que contienen diferentes concentraciones de sacarosa. Se indican las bandas más fuertes características para la sacarosa. Los espectros se corrigieron y se normalizaron al pico de deformación de etilo de 1300 cm-1.