Fundamentos de espectrometría de masas

INTRODUCCIÓN:  Es nuestro deseo contribuir a la transferencia de conocimiento en la comunidad profesional interesada y dedicada al análisis químico instrumental. En los años que llevamos de la segunda década del tercer milenio nuestro país ha incursionado en las nuevas tecnologías de espectrometrías de masas en gran parte por las exigencias que han surgido de los diferentes tratados de libre comercio y la evolución de nuestro sistema de justicia oral, en la cual se necesitan resultados indiscutibles en las cortes.

Sin embargo, la adopción de estas nuevas tecnologías no ha venido acompañada de un adecuado proceso de formación académica a los profesionales responsables de implementar las aplicaciones en los nuevos equipos, lo que ha generado demoras en el desarrollo de las nuevas técnicas analíticas y frecuentes fallas en los instrumentos, por esta razón consideramos que es nuestro deber como promotores y proveedores de estas nuevas tecnologías, contribuir activamente a la difusión del conocimiento necesario para que la aplicación de las tecnologías de espectrometría de masas sean exitosas.

Iniciaremos con la información fundamental de espectrometría de masas, ¿en qué consiste la espectrometría de masas?, luego detallaremos algunas de las tecnologías disponibles que son de mayor aplicación práctica en nuestro medio, de manera que nos concentraremos en las tecnologías cuadrupolares: de cuadrupolo sencillo en esta primera edición y de cuadrupolo triple en una próxima.

Siempre que se presenta la palabra “cuadrupolo” en una de nuestras presentaciones, surge la duda entre algunos de los asistentes sobre a qué se refiere este término, y aunque esto se puede explicar más adelante, podemos anticipar que esta denominación surge uno de los componentes de espectrómetro de masas que en esencia está constituido por cuatro barras magnéticas que constituyen una especie de imán de cuatro polos.

REVISIÓN DEL DESARROLLO DE LA ESPECTROMETRIA DE MASAS:

La espectrometría de masas, como técnica acoplada a la cromatografía, se implementó inicialmente en forma exitosa junto a la cromatografía de gases, gracias a que la muestra que genera el cromatógrafo de gases es transportada al espectrómetro en fase gaseosa, esto hizo que la tecnología desarrollada en el espectrómetro de masas fuera bastante robusta por lo que es en esencia la misma que actualmente se comercializa, después de más de 50 años de haber sido patentada (Los analizadores de masas cuadrupolares fueron desarrollados por Wolfang Paul de la Universidad de Bonn y patentada en 1.953 (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Spec_Masas.pdf)).

En los equipos de cromatografía de gases acoplados a espectrometría de masas se aplican los métodos de ionización que fueron inventados en 1.920 por Arthur J. Dempster de la universidad de Chicago quien desarrolló un analizador de iones formados por impacto electrónico (http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Spec_Masas.pdf), este tipo de ionización ofrece la ventaja de que la fragmentación que se produce de las moléculas es bastante reproducible, con lo cual es posible construir librerías de espectros contra las cuales se puede comparar los resultados y de esa forma identificar los compuestos que se analicen por este tipo de técnica.

Algunas moléculas son más susceptibles a la fragmentación por impacto electrónico y al ser impactadas se fragmentan en múltiples iones de tamaños pequeños dejando de existir la molécula completa por lo cual se dificulta su identificación, por esta razón se buscó la forma de generar procesos de ionización más débil que permitieran la identificación por espectrometría de masas de sustancias susceptibles, esto se logró mediante la ionización química que se ha incorporado a los espectrómetros de masas desde 1965. (https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8249/4/T5masas.pdf).

ACOPLE DE LA ESPECTROMETRIA DE MASAS A LA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Los primeros instrumentos de Espectrometría de masas que se comercializaron acoplados a cromatografía líquida, se basaron en el espectrómetro de masas que conocemos para gases y se desarrollaron interfaces para vaporizar el solvente en el que migran los analitos disueltos del cromatógrafo de líquidos (https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/940098.pdf), esto causaba que la mayor parte de la muestra de interés se perdiera en la interface de volatilización, lo que hacía a estos instrumentos de una muy baja sensibilidad. (https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/foodky.pdf)

Este inconveniente fue resuelto con la invención de la ionización por Electrospray en 1980, lo que le concedió el premio nobel de química en 2002 a John Bennett Fenn y marcó el desarrollo de la tecnología de espectrometría de masas en aplicaciones biológicas. (https://es.wikipedia.org/wiki/Ionizaci%C3%B3n_por_electrospray)

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Figura 1: Primera fuente de ionización Electrospray acoplada a un espectrómetro de masas de cuadrupolo. Instrumento exhibido en el museo de la fundación herencia química en Filadelfia PA. (https://es.wikipedia.org/wiki/Ionizaci%C3%B3n_por_electrospray#/media/File:Fenn_ESI_Instrument.jpg)

BUSQUEDA DE MAYOR RESOLCUIÓN DE MASA

La necesidad de contar con una herramienta capaz de identificar en forma indiscutible los compuestos llevó al desarrollo de nuevos instrumentos enfocados por un lado a mejorar la resolución de la selección de masa y por otro a generar mayor cantidad de información que permita identificar en forma más confiable los compuestos.

En la vertiente de creación de instrumentos de mayor resolución, se han desarrollado numerosas tecnologías, para nombrar solamente algunas tenemos:

  • Trampa de iones
  • Tiempo de Vuelo
  • Resonancia ciclónica por transformadas de Fourrier (FT-ICRMS).

Mientras tanto, en la vertiente que busca generar mayor información en un mismo experimento, se desarrolló la tecnología de triple cuadrupolo en tándem (Triple quad) que generó el primer equipo comercial en 1978 por Christie G Enke de la universidad del estado de Michigan en 1.978. (https://en.wikipedia.org/wiki/Triple_quadrupole_mass_spectrometer).

Para el propósito de este documento, nos concentraremos en la tecnología de espectrometría de masas de triple cuadrupolo.

FUNDAMENTOS DE LA TECNOLOGIA DE ESPECTROMETRIA DE MASAS BASADA EN CUADRUPOLO.

Como se mencionó inicialmente, los espectrómetros de masas que se acoplan tanto a cromatografía de gases como a cromatografía líquida, se componen esencialmente de tres elementos:

  • Fuente de iones
  • Separador de iones y
  • Detector de iones.
  • Soporte de vacío.

Los instrumentos que aplican la tecnología de cuadrupolo pueden ser acoplados tanto a cromatografía de gases como a cromatografía de líquidos, sin embargo existen diferencias de acuerdo al tipo de cromatografía a la cual se acoplen:

Instrumentos acoplados a Cromatografía de Gases;

  • Emplean fuentes de iones tipo Impacto electrónico
  • Emplean fuentes de iones tipo Ionización química

Instrumentos acoplados a Cromatografía líquida poseen fuentes tales como:

  • Fuentes de iones tipo Electro Spray que operan a presión atmosférica
  • Fuentes de iones tipo ionización química a presión atmosférica
  • Fuente de iones tipo foto ionización química a presión atmosférica.

Por lo anterior, no hay disponibilidad de un solo instrumento de espectrometría de masas que se acople simultáneamente a los dos tipos de cromatografía.

Para entender lo que ocurre en cada uno de los componentes, describiremos uno por uno a continuación:

- Fuente de iones: En esta parte del espectrómetro se producen los iones a partir de las moléculas de analito que llegan provenientes del cromatógrafo. Iniciaremos con las usadas al acoplar con cromatografía de gases:

  • Impacto electrónico: En esta fuente se hace pasar el analito en fase gaseosa a través de una lluvia de electrones generada por un filamento (Tungsteno o Renio), al pasar la molécula por esta “lluvia de electrones” se produce la fragmentación. El producto son iones de una única carga positiva que se forman cuando los electrones de elevada energía se acercan suficientemente a las moléculas para causarles la pérdida de electrones por repulsiones electrostáticas:
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Este tipo de ionización es muy reproducible si la energía con la cual se produce la “lluvia de electrones” es siempre la misma. Gracias a esto, hoy en día se cuenta con bases de datos muy completas de espectros de gran cantidad de moléculas que han sido fragmentadas por este medio y que son de gran utilidad para comparar los resultados obtenidos en cualquier parte del mundo y con esa comparación, es posible identificar la molécula bajo análisis.

  • Ionización Química: Cuando se usa este tipo de fuente de iones, se busca generar una ionización suave a una molécula que genera demasiados fragmentos cuando se intenta ionizar por impacto electrónico. En esta fuente se ioniza primero un gas el cual es usado como fuente de carga para transferirla a la molécula de interés, de esta manera el efecto de ionización no se aplica directamente a la molécula de interés, sino a un gas mediador como el metano o el amoniaco, el cual se inyecta en exceso respecto a la muestra a la cavidad de la fuente de iones, de manera que la probabilidad de ionización es mayor para las moléculas de gas que para las moléculas del analito, el gas ionizado luego le transfiere suavemente la carga a las moléculas de analito. De esta forma la molécula de interés no se fragmenta, solamente adquiere una carga, con lo que es posible obtener información del peso molecular de la molécula completa.
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Las fuentes de ionización más usadas en los equipos acoplados a cromatografía de líquidos:

  • Ionización por Electrospray: es una de las técnicas de ionización usadas para formar los iones provenientes de los eflujos de un cromatógrafo de líquidos, con esta técnica es posible realizar dos operaciones importantes en forma simultánea: Eliminar el solvente y generar los iones de las moléculas completas de los analitos. Esta técnica opera mediante la nebulización del fluido que llega del cromatógrafo mediante la inyección de un gas inerte (nitrógeno) y la aplicación de un fuerte campo eléctrico entre el capilar por el que entra la muestra y un contra electrodo. Por la acción del campo eléctrico, las gotas que se forman en la nebulización de la muestra adquieren una carga eléctrica elevada. A continuación las gotas por acción del vacío reducen su tamaño al punto que las moléculas disueltas se hacen tan cercanas que por acción de las fuerzas Culombicas de repulsión, hacen que se repelen con fuerza mayor a la tensión superficial del solvente y vuelan fuera de éste como partículas cargadas libres. Esto se conoce como evaporación iónica.
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  • Ionización Química a presión atmosférica: En este mecanismo de ionización los iones se producen de forma similar al Electrospray, con la diferencia que se genera una fuerte descarga en la fuente que ioniza el solvente en el momento que sale por el capilar y luego el solvente ionizado transfiere su carga a las moléculas de analito de la misma forma que la ionización química que se usa en los equipos acoplados a cromatografía de gases.
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Normalmente lo que ocurre es que el solvente cede o extrae un protón del analito. Dado que este fenómeno coexiste con la evaporación iónica descrita anteriormente, se producen abundantes iones (M+H)+ positivos y (M-H)- negativos.

  • Separadores de iones: como se comentó inicialmente, en este documento nos concentraremos en los separadores de masa de tipo cuadrupolar, aunque estos no son los únicos disponibles en el mercado si son los que ofrecen una mayor certeza en la cuantificación y al combinarlos en un diseño de triple cuadrupolo, podemos tener una elevada confiabilidad en aplicaciones de identificación.

En los separadores de iones se evalúan dos criterios:

Resolución: medida de la habilidad de un instrumento para separar iones de masas similares, m y m+ Δm, de igual intensidad, con superposición de señal de 10%

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En términos generales se considera que los cuadrupolos son parte del grupo de analizadores de baja resolución junto con las trampas de iones, de manera que la resolución que se logra con instrumentos basados en cuadrupolos no puede ser mayor a una unidad de masa atómica, es decir, no es posible distinguir entre dos moléculas cuya diferencia de peso molecular sea inferior a una unidad de masa atómica.

Al realizar un análisis de masas con un analizador cuadrupolar es posible obtener información del peso molecular que permite identificar la molécula, sin embargo si existen en la naturaleza otras sustancias con el mismo peso molecular o con una diferencia de peso inferior a una unidad de masa atómica (UMA), esta tecnología no permite diferenciar.

Un analizador cuadrupolar emplea cuatro barras metálicas a las cuales aplica una variación de campo magnético mediante radio frecuencia, haciendo que la polaridad se alterne entre los cuatro polos.

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Los iones formados en la fuente vuelan hacia el polo opuesto, pero el control de radiofrecuencia hace que la polaridad varíe antes de que la molécula llegue a chocar, cambiando su trayectoria, de tal manera que se selecciona la frecuencia ideal para que una molécula de un determinado peso molecular pueda viajar a lo largo del cuadrupolo y llegar al detector, con este tipo de control electrónico es posible lograr que solamente los iones de un solo peso molecular (relación masa carga) lleguen al detector (modo SIM) o para que desarrolle barridos en los que todas las moléculas presentes en la muestra lleguen al detector y se obtenga como resultado el espectro de todas las masas (modo SCAN).

El analizador tipo cuadrupolar tiene como ventajas que es más compacto que otros diseños y permite realizar barridos de amplios rangos de masa en muy cortos tiempos, actualmente Shimadzu ofrece velocidades de barrido de 20.000 unidades de masa atómica por segundo.

Con el propósito de hacer más selectivo el sistema de masas, se hizo uso de un equipo ideado en Australia por J.D. Morrison de la universidad de La Trobe para estudiar foto disociación de iones en fase gaseosa, del cual se construyó un equipo comercial en la Universidad de Michigan por Enke y Yost a finales de los años 70. Una vez en uso el instrumento se encontró que podía usarse para estudiar las moléculas orgánicas, y con ello se expandió su capacidad como técnica MS/MS en tándem, que hoy día lo conocemos como analizador de masas cuadrupolar.

  • Detectores de iones: uno de los detectores que han sido más utilizados en el detector de electrones de dinodos. En este tipo de detector el cátodo y los sucesivos dinodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de electrones al ser alcanzadas por iones o electrones de elevada energía.

El ión a detectar choca con el primer dinodo, provocando la emisión de un elevado número de electrones, los cuales inciden sobre un segundo dinodo, generando cada uno una emisión de numerosos electrones, con lo que se multiplica el efecto en cada dinodo en forma sucesiva, al final el efecto de amplificación puede ser de 108 . Este detector necesita alto vacío para su funcionamiento y su tiempo de vida es limitado ya que se desgasta con el uso, pero su velocidad de respuesta es muy rápida (regularmente inferior a 50ns) lo que permite realizar barridos mucho más veloces que otros tipos de detector. (https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8249/4/T5masas.pdf).

  • Soporte de vacío: En los instrumentos de Espectrometría de masas se debe contar con un ambiente de alto vacío para que los resultados producidos sean confiables, si el vació no es el apropiado dentro de la cámara de selección de iones o en el detector, las moléculas de aire y humedad presentes en la atmosfera se mezclan con los componentes de interés generando señales adicionales o ruido de fondo. Por esta razón, los instrumentos de espectrometría de masas cuentan con un poderoso soporte de vacío, normalmente compuesto por un mecanismo de bombeo primario que se ocupa de extraer la mayor cantidad de aire hasta llevar la cámara interna del espectrómetro a un vacío aproximadamente de 10-3 Torr. Una vez alcanzado este nivel de vacío, entra en operación un segundo mecanismo, el cual, en los equipos más sofisticados está basado en tecnología de bombas turbo moleculares, las cuales se ocupan de extraer el aire presente por debajo de 10-3 Torr y hacen alcanzar una presión de 10-6 Torr que es la ideal para los análisis de espectrometría de masas.
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Esquema de Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo con soporte de vacío, la bomba externa es la E2M28, este sistema cuenta con tres bombas turbo moleculares de 40, 260 y 210 Litros por segundo

Los factores que diferencian entre los instrumentos de espectrometría de masas con relación al vacío, son: la velocidad con la que alcanza el vacío y la presión hasta la que puede llegar la cámara, que como consecuencia práctica que se puede evaluar tenemos la relación señal a ruido, que generalmente se evalúa usando una solución de Reserpina.

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Evaluación de Señal ruido: En la parte superior los cromatogramas de 6 inyecciones repetidas de 50 pg de Reserpina, en la parte inferior el espectro obtenido. En el cromatograma se evalúa la diferencia de la señal obtenida con respecto al ruido, en este ejercicio se obtuvo una señal 400 veces superior al ruido.

El propósito de esta prueba es que al introducir una cantidad muy pequeña de esta sustancia, se obtenga una señal significativamente diferente al ruido de fondo que genera el instrumento.