Microscopia de Fluorescencia de reflexión interna total (TIRF Total internal reflection fluorescence)

La microscopia de fluorescencia de reflexión interna total TIRF es una técnica especial de la microscopia de fluorescencia desarrollada por Daniel Axelrod en la Universidad de Michigan y Ann Arbor a principios de la década de 1980. La microscopia TIRF suministra imágenes con resolución axial extraordinariamente alta por debajo de 100 nm. Esto permite la observación de procesos asociados a las membranas.

Microscopia TIRF

Permite tomar imágenes de moléculas fluorescentes ubicadas cerca de la interface vidrio/agua o vidrio/espécimen. Esto es logrado mediante el uso de una onda evanescente para excitar los fluoróforos en lugar de luz directa provista por lámparas de arco, LED o láser. El campo evanescente se forma si la luz incidente es totalmente reflejada en la interface de dos medios transparentes con diferentes índices de refracción (Fig.1). En aplicaciones biológicas la luz incidente es usualmente una luz láser y la interface el vidrio del cubreobjetos y una película de solución acuosa entre el cubreobjetos y las células adheridas.

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Figura 1. Ilustración del fenómeno óptico que sustenta TIRF. Tomado del centro de recursos de Olympus (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfintro.html)

Como la energía del campo evanescente disminuye exponencialmente con la distancia a la interface, únicamente los fluoróforos a cierta proximidad al cubreobjetos son excitados, esto permite la creación de imágenes con una extraordinaria relación señal a ruido, debido a que los fluoróforos en el resto de la célula son escasamente excitados. Adicionalmente, la microscopia TIRF suministra imágenes con una resolución axial extraordinariamente alta por debajo de 100 nm, permitiendo la observación de fenómenos asociados a las membranas como la adhesión de células, unión de hormonas, transporte de moléculas, procesos de exocitosis o endocitosis (por ejemplo: liberación y captura de neurotransmisores)

APLICACIONES EN BIOCIENCIAS

Mediante el uso de campo evanescente restringido espacialmente para excitar fluoróforos, la microscopia TIRF permite la observación de la ubicación y dinámica de moléculas y procesos en una sección óptica muy cerca o dentro de la membrana plasmática.

La microscopia TIRF es una excelente técnica para combinar estudios cinéticos con información espacial en muestras vivas o en vitro. Se aplica de forma rutinaria para investigar como ocurre el tráfico de moléculas (ej: Ensamble de cito esqueleto). La rápida adquisición de imágenes y la inmejorable eliminación de background de la microscopia TIRF, proporcionan condiciones apropiadas para observar eventos dinámicos como el reclutamiento de proteínas en la membrana plasmática. Así, es posible investigar la cinética del transporte mediado por dineina/kinesina, por ejemplo. También es posible hacer seguimiento a organelos como la mitocondria usando esta técnica. Para interacciones célula – célula, estructuras especiales tipo adhesiones focales de células pueden fácilmente ser visualizados con microscopia TIRF para observar la captura de partes del citoesqueleto para las adhesiones focales (Fig.2).

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Figura 2. (A) Imagen de fluorescencia de campo amplio de células de cáncer de mama expresando la molécula de adhesión celular CD44 marcada con GFP en la membrana celular. (B) La misma célula observada en TIRF Cortesía de Dra. Maria Montoya, centro nacional de cáncer de España, Madrid.

Otro gran campo de aplicación de la microscopia TIRF es la observación de procesos de fusión de membranas tales como el tráfico de vesículas. Como la onda evanescente únicamente excita fluoróforos cercanos a la membrana plasmática, es posible monitorear la formación de vesículas endocitócicas así como la fusión de vesículas secretoras con la membrana plasmática. Para este propósito las vesículas pueden ser marcadas mediante proteínas de carga que etiqueten la exocitosis como proteínas fluorescentes como GFP

Debido al seccionamiento óptico, es posible interpretar cambios en la intensidad de la fluorescencia como movimientos de las vesículas marcadas hacia dentro o fuera del campo evanescente o como toma o liberación de las proteínas. Una ganancia bastante lenta en intensidad podría implicar un movimiento hacia dentro del campo evanescente y por lo tanto un desplazamiento a través de la membrana plasmática. Tras la fusión de la vesícula secretora con la membrana plasmática, la señal fluorescente decrece rápidamente en la medida que la proteína de carga se libera al espacio extra celular. En forma inversa, la endocitosis puede ser observada usando sustratos fluorescentes como el dextrán marcado, el cual es tomado por la célula en procesos de endocitosis (Fig. 3).

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Figura 3. Visualización de un evento endocitótico simple en la membrana apical de células MDCK por TIRF.

doi:10.1152/ajprenal.00104.2015.Existe también la posibilidad de combinar la Microscopia TIRF con otras técnicas de microscopia como la EPI Fluorescencia para evidenciar fenómenos de exocitosis, en 2008 Pryazhnikov and Khiroug publicaron resultados que evidencian como la señal combinada de las dos técnicas permite visualizar el fenómeno de acoplamiento de una vesícula a la membrana y posteriormente como libera su contenido al exterior (Fig. 4) .

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Figura 4. Resultados de mediciones TIRF y Epifluorescencia que evidencian como se acopla una vesícula a la membrana.

Gracias a la combinación de técnicas es posible observar el acercamiento de la vesícula a la membrana, durante este periodo la Epi fluorescencia genera una señal estable ya que esta técnica no tiene resolución entre los fluoróforos que están cerca o lejos a la membrana. La señal TIRF, que sí diferencia los fluoróforos cercanos de los lejanos, se incrementa a medida que el fluoróforo se ubica cerca a la membrana (en un rango de 100 nm). Una vez la vesícula libera su contenido al exterior de la célula, la señal de ambas técnicas se reduce. Este tipo de resultados facilita enormemente el seguimiento a fenómenos dinámicos de transporte en las células.

En conclusión, la técnica TIRF es un avance significativo en microscopia ya que permite la visualización de eventos exclusivamente en la membrana plasmática. Olympus y PAF Ltda, su distribuidor autorizado para Colombia, ofrecen dicha tecnología de alto nivel a todos los investigadores que vean esta técnica como una herramienta útil para sus intereses de investigación.