Preparación de muestras aplicadas en métodos Bioanalíticos

Los métodos bioanalíticos incluyen métodos analíticos para monitorear sustancias activas en fluidos biológicos, con diferentes propósitos:

  1. Evaluar la farmacocinética y metabolismo de moléculas nuevas
  2. Comparar perfiles farmacocinéticos de diferentes formulaciones de sustancias activas
  3. Para monitorear en forma rutinaria de activos en pacientes para ajustar dosificación
  4. Para determinar activos y drogas de abuso con aplicaciones forenses

Estos métodos hacen necesaria una laboriosa preparación por lo complejo de las muestras, además los niveles en los que se buscan los analitos son extremadamente bajos, lo que representa un desafío para las tecnologías de detección. Adicionalmente este tipo de ensayos siempre involucra unos altos números de muestras.

Para atender estos requerimientos, actualmente se cuenta con técnicas como HPLC y UHPLC, la primera asegura la separación y detección pero puede requerir tiempos de análisis largos y en algunos casos escasa resolución. Para superar estas limitaciones, los laboratorios cuentan con varias tecnologías como: Cromatografía en columnas monolíticas, cromatografía de alta temperatura (HTLC), cromatografía de ultra alto desempeño UHPLC, cromatografía en columnas de centro fundido (fuse core columns) y cromatografía de interacción hidrofóbica.

En el artículo de revisión publicado por Lucie Novakova y Hana Vlckova en la Analytica Chemica Acta (Novakova, L & Vlcková, H (2009)) después de evaluar los métodos enumerados con diferentes metodologías analíticas, destacan cuatro de ellos como más favorables: HTLC, Cromatografía con columnas monolíticas, Cromatografía con columnas de centro fundido y UHPLC, la tabla No.1 resume las ventajas y desventajas de estos métodos.

T1
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De las cuatro, las dos técnicas más favorables, de acuerdo a este estudio, fueron la cromatografía con columnas de núcleo fundido y la UHPLC, pues son las que logran la mayor reducción en el tiempo de análisis con muy alta eficiencia. Además, existe disponibilidad de varias fases estacionarias de diferente selectividad en el rango inferior a 2 micras y en el de 2,7 micras. Si se revisa el aspecto de la estabilidad de la fase estacionaria, la UHPLC es ligeramente más ventajosa, debido a que se encuentran disponibles fases estacionarias más estables químicamente. Desde el punto de vista práctico, UHPLC es de forma inequívoca la técnica líder para separaciones cromatográficas.

Preparación de muestras

Las técnicas de preparación de muestras deberán ser escogidas y optimizadas de acuerdo al método de separación propuesto, una técnica apropiada se debe escoger atendiendo a su tiempo de extracción, selectividad, número de pasos, consumo de solvente y la posibilidad de ser usada en un sistema on-line.

Debido a que las muestras biológicas no son compatibles con los equipos HPLC, se deben preparar usando alguno de los métodos como: Separación líquido / Líquido, Extracción en fase sólida o precipitación de proteínas, los cuales se deben ejecutar manualmente con el consiguiente consumo de tiempo, lo que hace que la preparación se convierta en el cuello de botella de las metodologías analíticas.

Actualmente existen en el mercado dispositivos que permiten el procesamiento simultáneo de cientos de muestras en microplacas de 96 pozos (Millipore Co. 2010) o mediante la inyección directa de la muestra biológica a sistemas SPE en línea o mediante sistemas de extracción con materiales de acceso restringido (RAM).

La preparación de la muestra tiene un efecto importante en el análisis, puede afectar el resultado cualitativo y el cuantitativo. Por otro lado, la preparación de la muestra representa un 80% del tiempo del análisis.

Se usan con mayor frecuencia extracciones líquido / líquido y extracción en fase sólida, los cuales son muy laboriosos y consumen tiempo debido a la multitud de pasos necesarios, por esta razón se han venido desarrollando nuevos métodos como los listados en la tabla a continuación.

En la tabla 2 se resumen las características de algunas de las metodologías de preparación de muestra que son usadas en aplicaciones Bio analíticas:

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Los más recientes desarrollos se enfocan en reducir el volumen requerido de muestra, miniaturización y automatización, usando acoples con sistemas analíticos en línea.

Estabilidad de las muestras Biológicas:

Debido a la complejidad de este tipo de muestras, existen múltiples factores que pueden afectar su estabilidad como la temperatura de almacenamiento, enzimas y el pH, anticoagulantes y los ciclos de congelación / descongelación. Además de lo anterior, las muestras se pueden degradar durante la ejecución de los pasos del método de preparación y durante la ejecución del método de análisis. Por todo esto, se deben tomar varias alícuotas de la muestra original, también tomar muestras en los diferentes pasos intermedios como la extracción, el secado, la reconstitución y de la solución ya depositada en los viales.

Para asegurar la estabilidad de las muestras, se deben realizar estudios de estabilidad de corto y largo plazo así como de congelamiento y descongelamiento, tanto para las soluciones diluidas como para las muestras originales. Todo para asegurar que el procedimiento analítico escogido para analizar la muestra previene la ocurrencia de reacciones de degradación como: Foto degradación, reacción con fluido Biológico, absorción en la superficie de contenedores o en barreras como polímeros, reacciones de interconversión, epimerización o reacciones de isomerización. Factores como la Luz, la temperatura y el pH son determinantes para que se produzcan reacciones de degradación, por lo que los procedimientos de estabilización de las muestras deben contemplar el control de estos factores.

Las muestras se pueden estabilizar mediante adición de diferentes sustancias, como en el caso de sangre se adiciona ácido cítrico y en el caso de plasma soluciones buffer de citrato o fosfato con lo que se conserva el pH de la muestra durante el procesamiento y almacenamiento.

Otras sustancias que pueden ser usadas para conservar muestras son: EDTA, Acido fórmico, ácido acético, fluoruro de sodio, heparina de litio, oxalato de potasio y metil acrilato.

Recomendaciones para la preparación de fases móviles:

T5El tamaño reducido de las partículas usadas en UHPLC generan una presión muy alta durante la operación del instrumento, lo que presenta desafíos en la preparación de la muestra y de la fase móvil, cualquier impureza puede generar taponamientos en el sistema UHPLC causando fallas en el sistema.

La filtración por membrana remueve las partículas contaminantes de las muestras, solventes y fases móviles, con lo cual se incrementa la vida de la columna, minimizando la presión y previniendo la falla en el sistema, esta es la razón por la que los fabricantes de UHPLC recomiendan filtrar las fases móviles por filtros de 0,2 micras.

Las membranas que despliegan la más alta retención de partículas, tienden a ser más efectivas para minimizar la presión. Las membranas de poli propileno exhiben pobre retención de partículas y por lo tanto filtrar las fases móviles de UHPLC por membranas de polipropileno es menos efectivo para reducir la presión y el posible taponamiento de los equipos. En contraste, filtrar las fases móviles a través de membranas de PTFE, las cuales presentan excelente retención de partículas, habilitan al UHPLC para correr sin taponamientos significativos por presión.

Otras ventajas de filtrar las fases móviles y las muestras que se analizan por UHPLC a través de filtros de 0,2 micras son la mejora en la relación señal a ruido y mantener la limpieza en la línea de base del cromatograma. Para seleccionar el filtro apropiado se debe revisar la tabla de compatibilidad química de los filtros, además revisar cual es el volumen mínimo filtrable, pues cada filtro tiene un volumen que se queda en la estructura del filtro y algo muy importante, es la posible fijación de analito que se puede presentar a la membrana de filtración o al material del soporte de la membrana. En el caso de membranas fabricadas en PTFE los fabricantes ofrecen más del 90% de recuperación de los activos filtrados

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Las técnicas cromatográficas HPLC y UHPLC modernas usan cada vez mayores proporciones de agua y menores de solventes orgánicos, lo que nos obliga a tener un mayor cuidado con la calidad del agua que se usa en estas técnicas. De acuerdo a las BPL vigentes:

“10.10 El agua debe considerarse como un reactivo. Debe usarse el grado apropiado para un ensayo específico según se describe en las farmacopeas o en ensayos aprobados cuando estén disponibles”

“10.11 Se debe tomar precauciones para evitar la contaminación durante su suministro, almacenamiento y distribución”

“10.12 La calidad del agua debe ser verificada regularmente para asegurar que los diferentes tipos de agua cumplan con las especificaciones apropiadas” (Ministerio de Salud y protección social (2013) Resolución 3619)

Para cumplir con los requerimientos anteriores, es necesario contar con equipos capaces de producir agua de la calidad requerida para efectuar los ensayos UHPLC en el momento justo en que se requiere, esto para prevenir contaminación durante el almacenamiento. Estos equipos, deben ser capaces de realizar un registro continuo de la calidad del agua producida que nos permita contar con la trazabilidad de la calidad del líquido y así poder sustentar las características de pureza de los reactivos usados en una técnica de separación cuantitativa.

La calidad del agua contribuye a la estabilidad de la línea base de la cromatografía y al desempeño de las separaciones. (ver Gráfico 2) El uso de equipos que generan agua de alta pureza asegura fases móviles libres de impurezas orgánicas y garantizan la obtención de fases móviles libres de contaminantes orgánicas.

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En Purificación y Análisis de Fluidos S.A.S. encuentra un aliado estratégico que lo apoyará en el desarrollo de su estrategia de preparación de muestra, contamos con diferentes tipos de filtros y dispositivos, así como proveemos los equipos de purificación de agua que se ajustan a las necesidades de sus protocolos de preparación.