Tecnología de Citometría de flujo con imagen, Amnis

Los citómetros de Flujo con imagen AMNIS combinan la velocidad y tamaño de muestra de la citometría de flujo con la resolución y sensibilidad de la microscopia en un solo instrumento, a diferencia de cualquier otro analizador celular disponible. Con hasta 12 canales para cada célula en una población, las imágenes de microscopio proveen datos de imagen cualitativos y cuantitativos de cada evento adquirido en el flujo. Existen dos plataformas instrumentales: Flow Sight ® e ImageStream ® para ajustarse a sus necesidades de investigación y presupuesto.

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Beneficios de un citómetro de flujo con imagen:

1. La resolución es mucho mejor que un citómetro convencional:

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Si compramos estas dos imágenes, la primera obtenida con un citómetro de flujo tradicional y la segunda con AMNIS, vemos que la calidad de separación entre las poblaciones es mucho mejor ademas se aprecia muy claramente la diferencia en la intensidad de las señales y la distribución de la población.

2. Como si lo anterior no fuera suficiente, el operador puede elegir cualquiera de los puntos de la población y al señalarlo el software le presenta la imagen correspondiente a ese punto específico para que sea posible confirmar que las caracteristicas morfológicas de las células de cada población correspondan con la información que se genera por la citometria de flujo:

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3. Adicionalmente el software permite hacer el conteo de lóbulos en los nucleos de los neutroflos y otros análisis biológicos cuantitativos:

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Áreas de investigación en las que se puede aplicar esta tecnología:

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Pero como es que AMNIS ® logra hacer estas mediciones y tomar las imágenes de las células que están fluyendo?

La línea AMNIS® de Merck Millipore integra dos diferentes plataformas: Flow Sight ® e ImageStream®, las cuales se diferencian radicalmente en la estructura interna de sus ópticas:

En el image Stream® es posible configurar el instrumento en forma básica con una cámara, el cual se conformaría de los siguientes componentes:

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La corriente de células se ilumina con una fuente de luz blanca para poder captar la imagen de campo claro y un láser (en este modelo es posible instalar hasta 5 laser). A continuación está ubicado el capilar por el que fluye la muestra y a continuación se alinea el objetivo de magnificación del microscópio, el cual puede ser de 40X y se puede adicionar opcionalmente un mecanismo de selección de 3 objetivos, con lo que se puede contar además de 40x con 20x y 60x. El siguiente elemento, un espejo dicroico desvía parte de la luz hacia un dispositivo capaz de medir la velocidad de flujo de las células, lo cual es importante para poder sincronizar el registro de las imágenes en movimiento.

El instrumento incluye un elemento de descomposición espectral que garantiza la separación de la luz de diferentes longitudes de onda en ángulos diferentes para que la imagen de cada color incida en un área diferente sobre una cámara de alta resolución que captura las imágenes. De esta forma puede registrar hasta 6 imágenes simultáneamente en cada cámara, el equipo ImageStream® puede ser configurado hasta con dos cámaras.

Algunos reportes de aplicación exitosa de la tecnología AMNIS ® en investigaciones Biomédicas:

1. Señalización celular:

En general, la señalización celular es la comunicación mediante compuestos químicos (señales) que generan respuestas determinadas en las células diana de acuerdo a su maquinaria. Este tipo de comunicación es útil en una amplia variedad de manifestaciones de las células como: el movimiento, metabolismo, diferenciación, proliferación, muerte o supervivencia, y se puede llevar a cabo por moléculas secretadas o por moléculas unidas a la membrana plasmática. Algunas de las respuestas de las células a estos estímulos pueden ser: Actividad enzimática, cambios en la organización del cito esqueleto, cambios en la permeabilidad de iones, activación de la síntesis de ADN o la activación o represión de genes: En la siguiente gráfica podemos observar como AMNIS® genera imágenes que evidencian como se transloca complejo proteico NF-kB en un Monocito pasando del citoplasma al núcleo. AMNIS puede cuantificar el % de la población de células que sufren este proceso.

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2. Internalización:

Este campo de experimentación está relacionado con los mecanismos que usan las células para tomar moléculas de su ambiente circundante para ingresarlas al citoplasma celular y alli usarlas dentro de los procesos metabólicos celulares. Este campo de investigación es muy importante en el desarrollo de moléculas con actividad farmacológica, en especial, moléculas de características protéicas o peptidicas que tienen bastantes limitaciones para ser absorbidas por las células vivas, en este campo se investiga la forma de facilitar el ingreso de moléculas potencialmente activas a las células mediante fusion con proteinas de transporte e incluso con nanopartículas.

Otro campo en el que resulta de importancia el estudio de la internalización es en Inmunología, y en la investigación de enfermedades infecciosas, medinte el estudio de la internalización es posible entender los mecanismos que usan los parásitos, los virus o las bacterias para infectar las células de sus victimas.

En la siguiente imagen se puede apreciar como el AMNIS® puede mostrar el acercamiento de las moléculas de CpGB a las células del sistema inmune:

En esta imagen de campo claro se puede apreciar la célula mononuclear PBMC y la molecula de CpGB marcada en rojo en la parte exterior de la célula.

En el experimento reportado por Millipore, el interés se centra en una de las líneas celulares mononucleares de sangre periferica, la pDC o células dendriticas, las cuales son teñidas con BDCA PE para diferenciarla de otras células de sangre periférica, esto les dá un color naranja en su membrana. Adicionalmente, para poder evidenciar la internalización del CpGB a la célula, se tiñen los organelos del interior de la célula con CD71 o CD107a que genera una coloración verde, de esta forma lo que se visualiza es:

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El resultado es expresado por AMNIS como una gráfica de comparación de poblaciones en la cual el eje X presenta la similaridad de la imagen clara entre la tinción de los organelos internos con la posición de CpGB, con esto se puede saber si el CpGB se ubica cerca o junto a organelos internos (colocalización). En el eje Y se cuantifica la internalización de CpGB, es decir, cuales de las células observadas presentan en su interior señal de CpGB.

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3. Cuantificación de Apoptosis:

Merck Millipore reporta un experimento de seguimiento de la ruptura del DNA que es un marcador del fenómeno de Apoptosis (muerte celular programada), al romperse el DNA la imagen del DNA teñido debe apreciarse de menor tamaño. En imágenes de campo claro tomadas por AMNIS se vé la diferencia entre la célula normal y la que sufre apoptosis inducida por Camptothecina a dosis alta (5uM)

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Con esta información esperamos mostrar una panorámica general de la tecnología de Citometría de flujo de alta resolución con imagen acoplada como una solución a los requerimientos de la investigación actual y que representa una herramienta para garantizar resultados de calidad para las mas exigentes publicaciones internacionales.